在病理科研與腫瘤機(jī)制研究中，多重?zé)晒饷庖呓M化憑借可在同一張組織切片上同時(shí)定位多種靶蛋白、還原腫瘤微環(huán)境細(xì)胞空間分布關(guān)系的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為空間蛋白組研究、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析重要的檢測(cè)手段。相較于傳統(tǒng)單指標(biāo)免疫組化，多重?zé)晒饷庖呓M化能夠同步獲取多靶點(diǎn)空間表達(dá)數(shù)據(jù)，大幅節(jié)約珍貴的臨床組織樣本，提升實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)性與參考價(jià)值。但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)開展過程中，很多科研人員為了縮短實(shí)驗(yàn)周期、減少樣本消耗，往往直接開展多指標(biāo)同步染色，跳過前期單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終出現(xiàn)信號(hào)偏弱、非特異性染色嚴(yán)重、熒光光譜串色、靶點(diǎn)信號(hào)相互干擾等一系列問題，直接導(dǎo)致整張切片報(bào)廢，浪費(fèi)大量臨床稀缺樣本與實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
多數(shù)研究者認(rèn)為，只要參考過往成熟的實(shí)驗(yàn)方案，直接進(jìn)行多重染色即可得到合格結(jié)果，單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)只是重復(fù)且多余的步驟。但事實(shí)上，單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)是整個(gè)多重?zé)晒饷庖呓M化實(shí)驗(yàn)的底層基石，絕非可有可無的附加流程，它能夠提前規(guī)避絕大多數(shù)后期無法補(bǔ)救的實(shí)驗(yàn)隱患，其核心價(jià)值遠(yuǎn)超單純的時(shí)間成本消耗，具體作用體現(xiàn)在四個(gè)關(guān)鍵層面。
首先，單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)可以獨(dú)立驗(yàn)證每一種一抗與組織樣本的適配性，排除抗體本身與樣本不匹配帶來的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)失敗。不同來源的組織樣本保存條件、固定時(shí)間、抗原保留程度存在天然差異，即便同一種抗體在既往實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)穩(wěn)定，更換批次樣本或者更換組織類型后，染色效果也會(huì)出現(xiàn)明顯波動(dòng)。直接做多重染色時(shí)，多種抗體共同孵育，一旦出現(xiàn)無陽(yáng)性信號(hào)或者背景染色過高，研究者無法快速分辨究竟是哪一種抗體失效、抗原修復(fù)條件不適宜，還是孵育時(shí)間不合理。而單一抗體獨(dú)立染色能夠精準(zhǔn)定位問題源頭，單獨(dú)優(yōu)化每一個(gè)靶點(diǎn)的抗原修復(fù)時(shí)長(zhǎng)、抗體孵育環(huán)境以及封閉條件，保證每一個(gè)靶點(diǎn)都能達(dá)到最佳的特異性染色效果，從源頭杜絕單一靶點(diǎn)缺陷拖累整張多重切片的檢測(cè)結(jié)果。
其次，單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛱崆芭挪闊晒舛怪g的交叉反應(yīng)，解決多重染色最常見的信號(hào)串?dāng)_難題。多重?zé)晒馊旧暮诵碾y點(diǎn)在于多種熒光標(biāo)記二抗共存于同一切片體系中，不同二抗之間極易發(fā)生非特異性結(jié)合，同時(shí)不同熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜會(huì)出現(xiàn)重疊干擾，造成假陽(yáng)性信號(hào)。在單標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，每一種熒光二抗單獨(dú)作用于組織切片，能夠清晰觀察該熒光通道的本底熒光強(qiáng)度、自發(fā)熒光干擾程度以及二抗是否存在非特異性吸附。通過單獨(dú)確認(rèn)每個(gè)通道純凈的基礎(chǔ)信號(hào)，后續(xù)搭配多重染色組合時(shí)，就可以合理排布抗體先后孵育順序、調(diào)整熒光通道搭配方式，避免高亮度熒光通道掩蓋低表達(dá)靶點(diǎn)的微弱信號(hào)，從根本上減少光譜串色帶來的結(jié)果誤判。
再者，單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)大程度保護(hù)稀缺臨床組織樣本，降低科研樣本損耗成本。臨床手術(shù)標(biāo)本、疑難病例組織切片具有bu可再生性，很多小眾疾病、罕見腫瘤的組織樣本數(shù)量極少，無法反復(fù)補(bǔ)做實(shí)驗(yàn)。直接開展多重染色一旦失敗，整張切片所有靶點(diǎn)數(shù)據(jù)全部作廢，沒有拆分排查問題的空間。而單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)僅需要少量備用切片完成抗體驗(yàn)證與條件摸索，即便預(yù)實(shí)驗(yàn)效果不佳，也不會(huì)損耗正式實(shí)驗(yàn)的核心樣本。同時(shí)經(jīng)過單標(biāo)優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件，直接套用至多聯(lián)染色體系，一次實(shí)驗(yàn)成功率可以大幅提升，反而整體縮短了完整實(shí)驗(yàn)的周期，看似多做了一輪前期實(shí)驗(yàn)，實(shí)則規(guī)避了后期全盤返工的時(shí)間浪費(fèi)。
最后，單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)可以建立單一靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)參照，保障多重實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀的準(zhǔn)確性。科研實(shí)驗(yàn)中蛋白表達(dá)強(qiáng)弱需要客觀參照標(biāo)準(zhǔn)，多重染色下多個(gè)信號(hào)相互疊加，很難判斷單個(gè)靶點(diǎn)的表達(dá)水平是否真實(shí)、信號(hào)是否被其他熒光信號(hào)壓制。單標(biāo)染色得到的純凈陽(yáng)性切片，可作為每個(gè)靶點(diǎn)的陽(yáng)性對(duì)照，后續(xù)分析多重切片時(shí)，能夠?qū)φ諉螛?biāo)結(jié)果區(qū)分真實(shí)特異性信號(hào)與疊加產(chǎn)生的偽信號(hào)，避免后期圖像分析、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)出現(xiàn)結(jié)果偏差，保證最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性與可重復(fù)性，讓論文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)得起同行復(fù)盤與審核。
總而言之，多重?zé)晒饷庖呓M化的實(shí)驗(yàn)邏輯是由簡(jiǎn)到繁，而非一步到位。多重染色所有的信號(hào)干擾、抗體兼容、抗原修復(fù)問題，都可以在簡(jiǎn)單的單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)中提前化解。省去單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)看似提升了實(shí)驗(yàn)效率，實(shí)則是忽視了免疫組化實(shí)驗(yàn)個(gè)體差異性的盲目操作，最終往往需要付出樣本報(bào)廢、數(shù)據(jù)無效、實(shí)驗(yàn)返工的沉重代價(jià)。對(duì)于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目臻g蛋白學(xué)研究而言，單標(biāo)預(yù)實(shí)驗(yàn)不是可選流程，而是保障多重?zé)晒饷庖呓M化結(jié)果可靠、數(shù)據(jù)精準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)可重復(fù)的必要前提，這也是絕大多數(shù)成熟病理平臺(tái)始終堅(jiān)持該操作流程的核心原因。
